miRNA测序
小RNA是生物体内一类具有重要调控功能的非编码短小RNA的总称。大量研究已经证实，小RNA几乎参与调控了动植物所有的生命过程，包括细胞增殖，分化，凋亡等，并且与人类疾病的发生发展密切相关。小RNA测序正是对这一类重要的调控小RNA——特别是microRNA（miRNA）展开分析，利用高通量测序技术对样本中18~30nt的小RNA序列进行鉴定和分析。技术优势文库优化：针对动植物miRNA序列的不同特别，优化文库制备流程，最大程度地富集样本小RNA序列独家分析软件：拥有自主开发的数据分析软件ACGT101-miR，可靠性已被数百个实验项目检验；生成图表可直接用于论文撰写。项目经验丰富：国内最早提供小RNA测序服务的公司之一，用户已发表上百篇小RNA测序相关论文。技术路线Total RNA3’及5’接头连接反转录PCR扩增PAGE纯化上机测序（HiSeq 2500，SE50）数据分析分析内容1、数据质控：测序质量值分布统计；测序碱基质量控制；测序数据产出统计。2. 可比对测序数据的获得3. miRNA数据库以及测序物种基因组比对4. 与其他RNA数据库的比对5. 预测全新的miRNA6. miRNA序列本身相关分析7. miRNA定量分析，多样品miRNA的表达差异分析；差异表达miRNA筛选；差异表达miRNA统计；miRNA表达模式聚类分析（仅限多样本项目）。8. 重复相关性检测(仅限生物学重复样本)。9. 差异表达miRNA的靶基因预测（植物采用Targetfinder软件，动物采用Targetscan和miRanda软件0）10. 差异表达miRNA的靶基因GO，KEGG注释与GO，KEGG富集性以及pathway 通路分析和pathway network分析。（仅限多样本项目）差异表达miRNA的靶基因GO，KEGG注释与GO，KEGG富集性以及pathway 通路分析和pathway network分析。（仅限多样本项目）样本类型细胞，组织，体液、血清、血浆、全血，总RNA等建议总RNA起始量：5 μg，最低2.5 μg，浓度≥120 ng/μL样本类型1.Wu S, Li Y, Chen S, Liang S, Ren X, Guo W, Sun Q, Yang X. (2017) Effect of dietary Astragalus Polysaccharide supplements on testicular piRNA expression profiles of breeding cocks. International Journal of Biological Macromolecules 103(1), 957-964.2.Tritten L, Tam M, Vargas M, Jardim A, Stevenson MM, Keiser J, Geary TG. (2017) Excretory/secretory products from the gastrointestinal nematode Trichuris muris. Experimental Parasitology 178(1), 30-36.3.Sun J, Yao L, Chen T, Xi Q, Zhang Y. (2017) The effect of dietary ginseng polysaccharide supplementation on the immune responses involved in porcine milk-derived esRNAs. bioRxiv [Epub ahead of print].4.Ghorecha V, Zheng Y, Liu L, Sunkar R, Krishnayya NSR. (2017) MicroRNA dynamics in a wild and cultivated species of Convolvulaceae exposed to drought stress. Physiology and Molecular Biology of Plants 23(2), 291-300.5.Li H, Peng T, Wang Q, Wu Y, Chang J, Zhang M, Tang G, Li C. (2017) Development of Incompletely Fused Carpels in Maize Ovary Revealed by miRNA, Target Gene and Phytohormone Analysis. Frontiers in Plant Science 8(1), 463.案例展示同源四倍体和二倍体水稻花粉发育过程中的小RNA分析与比较1.研究背景MicroRNAs (miRNAs)通过抑制其靶基因来调控植物基因的表达，且在植物生殖中起着重要的作用。然而，目前关于同源四倍体水稻miRNA组分析的研究是相当有限的。2.研究结果在这项研究中，研究人员运用小RNA测序对二倍体和多倍体水稻花粉发育过程中的miRNA组进行分析。研究结果表明，与二倍体水稻相比，四倍体水稻中共检测出172种差异表达的miRNAs（DEM），以及57种miRNA在同源四倍体水稻中特异性表达。在这172种DEM中，115种miRNA上调，61种miRNA下调。上调DEM的靶基因GO分析表明，它们的功能富集在减数分裂前间期的膜运输、减数分裂繁殖和单小孢子阶段的核苷酸结合。 osa-miR5788和osa-miR1432-5p_R+1在减数分裂时上调，它们的靶基因揭示了减数分裂相关基因的相互作用，也暗示了它们可能参与染色体行为相关的基因调控。此外，在同源四倍体水稻的花粉发育过程中，发现了丰富的与转座因子相关的24 nt 的siRNA；但是，它们在二倍体水稻中的含量明显下降，表明24 nt的siRNA在花粉发育中可能发挥作用。 图 花粉发育过程中不同阶段miRNA表达的Venn图分析本研究的结果为miRNA在同源四倍体水稻花粉发育过程中所起的作用，以及其与花粉不育性之间的关系提供了新的见解，为理解小RNA表达谱对多倍体的影响奠定了基础。参考文献Li, et al. (2016) Comparative Small RNA Analysis of Pollen Development in Autotetraploid and Diploid Rice. InternationalJournal of Molecular Sciences. 17, 499; doi:10.3390/ijms17040499结果展示1.差异miRNA上下调统计分析差异基因上下调频数统计用于判断不同实验条件下差异表达miRNA的个数。其中横坐标表示比较组信息，纵坐标表示上下调miRNA的数目，红色代表上调miRNA，蓝色代表下调miRNA，其中数字代表上下调miRNA的数目。 2.差异miRNA聚类分析差异miRNA聚类分析用于判断miRNA在不同实验条件下调控的聚类模式。根据样品miRNA表达谱的相近程度，将miRNA进行聚类分析，直观地展示miRNA在不同样品（或是不同处理）中的表达情况，由此获取生物学相关信息。不同的颜色表示不同的miRNA表达水平，颜色由蓝色经由白色至红色表示表达量从低到高。红色表示高表达基因，深蓝色表示低表达基因。 3.差异miRNA韦恩图通过不同比较组之间差异基因韦恩图可以直观地显示出不同比较组之间共同的和特有的差异表达miRNA的个数，差异基因韦恩图具有明显的生物学意义，比如是相同对照不同处理的实验设计情况，可以将不同处理下的差异基因进行比较。4.GO富集性柱状图miRNA靶基因的GO富集柱状图：用于反映在生物过程(biological process)、细胞组分(cellular component)和分子功能(molecular function)富集的GO term上差异基因的个数分布情况。5.GO富集性散点图对差异miRNA进行GO富集分析并以散点图展示，Rich factor表示位于该GO的差异基因个数/位于该GO的总基因数，P值越小，GO富集程度越高。常见问题 1.miRNA命名规则是怎样的？关于miRNA命名，是根据miRBase的命名规则：物种拉丁名3字母缩写-miR/MIR-编号（植物），miR表示的是microRNA成熟体，植物的前体使用MIR。参见miRBase官网:目前已经不再使用*来标记microRNA与其发夹前体互补配对位置的互补序列，而是使用“-3p”与“-5p”作为区分这两条序列的后缀替代旧的的命名法。具体参考17.0版本出来时，miRbase数据库的blog文章：http://www.mirbase.org/blog/2011/04/mirbase-17-released/ 2.如何筛选差异基因？可以在筛选的时候可能需要参考该参数，一般如果专注于发现，那么全部保留，如果专注于差异表达，可以仅保留high和middle拷贝的。log2(Treat/Control)>0表示上调，1表示上调2倍，0表示上调，1表示上调2倍，3.ACGT101程序的优势有哪些？优势有以下几点：1）分析全程兼顾测序质量打分（phred score）；2）比对已报道成熟体之前先与已报道前体序列比对，除了发现全新的miRNA序列，还可以发现另一末端的成熟体序列，以及已报道成熟体的侧翼miRNA序列；3）与其他RNA数据库的比对过滤在于miRBase数据库比对之后，避免了滤除那些少量比对上编码区域的已报道miRNA；4）Table 5结果数据信息丰富全面，全部结果都有迹可循;5）100篇客户参考文献。
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